论p120ctn 亚型肺癌免疫荧光表达及意义

作为连环素家族的新成员，在细胞黏附和信号转导中起着至关重要的作用 [1-4]。
　　它的基因有21 个外显子，根据其剪切的不同，理论上p120ctn 可产生32 个亚型，所有的亚型都具有相同的犰狳(Armadillo)重复序列，只是C 端或N 端不同[5]。根据其起始翻译密码的不同人类的p120ctn 可分为4 种亚型，但各亚型的生物学功能至今尚未阐明[6,7]。目前在人肺癌中的研究很少，其在肺癌中表达的亚型种类及表达情况仍不清楚。本研究采用免疫荧光和Western Blot 方法，观察了p120ctn 及其各亚型在肺鳞癌、腺癌中的表达及意义，并探讨其与肺癌的临床病理因素的关系。
　　材料与方法材料例原发性肺癌及对应癌旁正常肺组织来自2003 年11 月至2004 年9 月在中国医科大学第一附属医院行外科手术切除的新鲜标本。 患者术前均未接受过放化疗。标本取出后立即放入-70℃冰箱保存备用。其中男37 例，女13 例，平均年龄59 岁（32-78 岁）。按年WHO 肺肿瘤组织学分类标准[8]，鳞癌15 例，腺癌35 例；高分化12 例，中分化23 例，低分化15 例；有淋巴结转移22 例，无淋巴结转移28 例。依据国际抗癌联盟(UICC)1999 年修订的肺癌p-TNM 分期标准[9] ：Ⅰ期13 例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期27 例。
　　方法冰冻组织切片和免疫荧光染色观察取新鲜肺癌和癌旁正常肺组织标本 OCT 包埋，快速冷冻后制成5μm 厚的切片，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，冷丙酮固定10min 后晾干备用。
　　固定后的冰冻组织切片用0.2% Triton X-100 处理15min。正常非免疫动物血清37℃孵育30min。滴加p120ctn 鼠抗人单克隆抗体（1:400，BD Transduction Laboratories），4℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，每次5min，重复三次。滴加罗丹明标记羊抗鼠荧光标记二抗（1:200，北京中杉），37℃孵育30 分钟。PBS 冲洗，每次5min，重复三次。DAPI (1:200，SIGMA 公司)核复染30min；PBS 冲洗；50%甘油封片，荧光显微镜于波长为527nm 处观察罗丹明荧光强度,于372nm 波长处观察DAPI 的荧光染色,确定p120ctn 的表达及定位。
　　从新鲜肺癌和癌旁正常肺组织标本中取0.125cm3 左右大小的组织块，加入500μL 裂解液中冰浴下匀浆，4℃静置24h，低温高速离心（4℃、13000 转/分、30min），收集上清。中国硕士论文网为您提供公共管理硕士论文。
　　用考马斯亮兰法，以牛血清蛋白作为标准进行蛋白定量，计算各样品蛋白浓度。
　　将含 50μg 总蛋白的组织裂解产物进行SDS-PAGE 电泳1.5h 后，转印至PVDF 膜（100V，），5%脱脂奶粉室温封闭1h，经TTBS（20mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，）冲洗3 次，抗p120ctn 单克隆抗体（1：400，BD Transduction Laboratories）4℃孵育过夜后，辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1h，TTBS 洗三次后DAB 显色。以β为内对照，用凝胶成像分析系统（Biolmaging Systems,美国）测定p120ctn 各条带灰度值，并取其与β-actin 的比值为相对表达量分析p120ctn 各亚型的表达情况。
　　统计分析利用 SPSS for Window 11.5 进行统计分析。p120ctn 及其亚型在正常支气管上皮和癌中表达的关系采用Wilcoxon 符号检验, p120ctn 及其亚型表达与临床病理因素的关系采用秩相关检验，P＜0.05 有统计学意义。
　　结果免疫荧光结果在癌旁正常肺组织中的支气管上皮细胞胞膜上强表达，呈现完整、连续的红色强荧光，而在肺癌细胞中p120ctn 的膜荧光表达明显减弱，呈现不连续或缺失，并可出现胞浆表达（图1）。
　　结果参照预染蛋白分子量标准（赛百盛，北京，中国），在癌旁正常肺组织可见100KDa 和附近有特异性的条带，对应位置相当于p120ctn 的亚型1(120KDa)和3(100KDa)，而在肺癌组织中亚型1 和3（尤其是亚型1）多表现为缺失或减弱（图2）。
　　对Western Blot 图像结果的分析表明，包括1 和3 亚型在内的p120ctn 总蛋白在癌旁正常肺组织中的表达明显高于肺癌组织(P＜0.001，n=50)。p120ctn 的.亚型1 和亚型3 在癌组织中的表达均有不同程度的缺失或减弱（P=0.001，n=50；P＜0.001，n=50)。亚型1 的缺失与各临床病理因素无关,而亚型3 的表达缺失与淋巴结转移呈负相关（P=0.005，n=50，r=0.397），与其他临床病理因素无关（表1）。